Envelhecimento e doenças neurodegenerativas crônicas na Amazônia brasileira: implantação de novas metodologias de avaliação em pacientes com declínio cognitivo leve e doença de Alzheimer

Em 2025 o número de idosos no mundo irá dobrar e por volta de 2050 alcançará dois bilhões de indivíduos, estando a maioria em países desenvolvidos. A doença de Alzheimer (DA) é a quarta doença que mais compromete a qualidade de vida dos idosos. Este trabalho pretende sugerir novas metodologias de avaliação de pacientes com declínio cognitivo e doença de Alzheimer, apresentando uma versão brasileira a partir da versão original em língua inglesa intitulada “Test Your Memory” TYM (“teste sua memória- TSM), bem como mostrar os resultados do desempenho dos idosos na bateria de testes neuropsicológicos de Cambridge (CANTAB). Trata-se de estudo analítico, transversal retrospectivo do tipo caso-controle, realizado em pacientes do ambulatório de Geriatria do Hospital Universitário João de Barros Barreto, e em voluntários da comunidade no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2011. Participaram 95 indivíduos com 65 ou mais anos de idade, divididos em 3 grupos: Alzheimer (DA, n=21), declínio cognitivo (DCL, n=31) e controle (n=43). Foram excluídos pacientes com história de acidente vascular encefálico (AVE), depressão primária, trauma cranioencefálico, outras demências, outras patologias neuropsiquiátricas e déficits visuo-auditivos limitantes. Os participantes foram submetidos à avaliação inicial, triagem com GDS-5 e DSM-IV, ao Questionário Internacional de Atividades Físicas (IPAQ), testes neuropsicológicos da bateria CERAD, teste do relógio, TSM (versão adaptada para o Português) e a bateria de Alzheimer do CANTAB. A análise estatística foi realizada empregando-se ANOVA, um critério, definindo-se o valor p<0,05 como significante. Houve predomínio em todos os grupos de indivíduos do gênero feminino, de cor parda, na faixa etária de 70 a 79 anos. A média de pontuação do MEEM entre os três grupos foi diferente (controle: 26,6±2,2; DCL: 25,1±2,6; DA: 17,3±4,9; p<0,05), entretanto o TSM mostrou ser uma ferramenta de triagem mais confiável para distinguir os pacientes DCL dos DA (controle: 42,4±5; DCL: 35,5±7,7; DA: 25,7±8; p<0,01). Na lista de palavras do CERAD, teste do relógio, TNBR e na fluência verbal fonológica os três grupos apresentaram diferenças significantes na média de pontos obtidos. A média da pontuação total no TSM foi significativamente menor nos grupos DCL e DA do que no grupo controle, e no grupo DA em relação ao DCL. Os testes e medidas do CANTAB que separam os três grupos pelo desempenho obtido são: RVP A‟, número de tentativas para o sucesso e total de erros na fase de 6 figuras do PAL. Foram encontradas boas correlações entre o TSM e outros testes, principalmente com o MEEM (Coeficiente de Pearson, r = 0,79; p<0,0001) e teste do relógio (r = 0,76; p<0,0001), bem como boa correlação entre as medidas do PAL e a pontuação do TSM e o MEEM. O nível de atividade física no grupo controle foi maior do que em todos os outros grupos. Ao ser correlacionado o nível de atividade física e o desempenho nos testes cognitivos, não foram observadas diferenças significativas nos diferentes grupos, exceto pela evocação de palavras no grupo DCL. Tomados em conjunto os resultados sugerem que a aplicação de testes neuropsicológicos automatizados associados aos testes da rotina clínica e ao TSM aumentam a resolução e a confiabilidade das análises particularmente no estágio inicial das síndromes demenciais onde a precocidade e a precisão diagnóstica são fundamentais para orientar as ações terapêuticas, sejam elas medicamentosas e/ou comportamentais.

Estudos de microsatélites em humanos: aplicações na identificação de indivíduos, genética de populações, datação de mutações e diagnóstico de doenças

Os microsatélites, também chamados STRs (Short Tandem Repeat), são pequenas sequências de DNA que consistem numa sequência de repetições de um motivo que varia de um a seis pares de bases. Existem em quase todos os cromossomas humanos e podem situar-se nos exões ou nos intrões. Estes últimos são altamente polimórficos e são por isso utilizados na identificação de indivíduos em testes de paternidade e também em estudos de genética de populações. A combinação dos vários genótipos possíveis faz com que cada indivíduo possua um perfil único, que permite a sua identificação. Existem também microsatélites associados a exões ou a regiões promotoras dos genes, normalmente repetições trinucleotídicas CGG/CCG ou CAG/CTG, associados a doenças neurodegenerativas como a síndrome do X-frágil e a doença de Huntington. Neste trabalho caracterizaram-se geneticamente várias populações humanas dos arquipélagos da Madeira, Açores e Cabo Verde. A partir do estudo dos microsatélites do cromossoma Y, foram definidas idades de coalescência que permitiram concluir que as cópias do gene DAZ situado no cromossoma Y são o resultado de um processo evolutivo estando a sua evolução associada a alguns haplogrupos. Verificou-se também a ocorrência de possíveis mutações nos SNPs que definem os haplogrupos, através da comparação dos microsatélites do cromossoma Y dentro de cada haplogrupo, especialmente no haplogrupo E3b. Verificou-se existir uma associação entre o número de repetições CAG e GGC do gene Receptor de Androgénios (AR), situado no cromossoma X, e a infertilidade especialmente quando combinados os dois polimorfismos, parecendo haver um efeito protector dos alelos maiores e alguma susceptibilidade para os alelos menores. Quando se estudou o número de repetições GGC do gene FMR1 em doentes com suspeita de síndrome de X-frágil observaram-se diferenças significativas quando comparadas com a população em geral e com um grupo de sobredotados. Essa diferença deveu-se principalmente à presença do alelo 29 em quase todos os indivíduos do primeiro grupo o que por si só não constitui um factor de risco mas poderá ser uma indicação da associação deste alelo com outra mutação no mesmo gene que possa ser responsável por este fenótipo.

Características bioativas, funcionais e efeito protetor do resíduo desidratado de camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. (McVaugh)) sobre doenças degenerativas utilizando modelos in vivo C. elegans

Camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. (McVaugh)) is a native Amazon fruit, recognized worldwide as one of the main natural sources of ascorbic acid. Due to its great acidity, this fruit is generally consumed after processing into juice or as ingredient in food preparations. As a co-product of the camu-camu processing, a significant amount of agroindustrial residue is generated. Despite the studies showing the bioactive value and biological potential of the fruit, few studies have approached the possible processing techniques, transformation and preservation of camu-camu fruits and its agroindustrial pomace. Therefore, the present work has the objective of evaluating two different drying processes applied to camu-camu pomace (peel and seeds with residual pulp), freeze drying and hot air drying, in order to obtain a functional fruit product. This thesis was divided into three stages: the first one shows the studies related to the freeze drying and hot air drying, where we demonstrated the impact of the selected drying techniques on the bioactive components of camu-camu, taking the fresh pomace as the control group. Among the investigated conditions, the groups obtained at 50ºC and 4 m/s (SC50) and 80ºC and 6 m/s (SC80) were selected as for further studies, based on their ascorbic acid final content and Folin-Ciocalteau reducing capacity. In addition to SC50 and SC80, the fresh pomace (RF) and freeze dried (RL) samples were also evaluated in these further stages of the research. Overall, the results show higher bioactive concentration in the RF samples, followed by RL, SC50 and SC80. On the second step of the research, the antioxidant, antimicrobial and antienzymatic activities were evaluated and the same tendency was observed. It was also reported, for the first time in the literature, the presence of syringic acid in dried camu-camu pomace. In the third and final stage of the research, it was investigated the effect of dried camu-camu on aging and neuroprotective disorders, using the in vivo model C.elegans. It was observed that camu-camu extracts were able to modulate important signaling genes relevant to thermal and oxidative stresses (p < 0.05). The polar acid, polar basic and polar neutral fractions obtained from the low molecular extracts of SC50 were able to extend the lifespan of wild type N2 C. elegans in 20% and 13% (p < 0.001). Results also showed that the paralysis induced by the β1-42 amyloid was significantly (p < 0.0001) retarded in CL4176 worms. Similarly, the camu-camu extracts attenuated the dopaminergic induction associated to Parkinson’s disease. Finally, a global analysis of the data presented here reveal that the camu-camu pomace, a co-product obtained from the industrial processing of a native Brazilian fruit, is a relevant natural source of health relevant compounds. This thesis, shows for the first time, the multifunctionality of camu-camu pomace, a natural resource still underexploited for scientific, commercial and technological purposes.

Efeitos da associação entre dieta hiperlipídica e ovariectomia sobre aspectos comportamentais, lipídeos séricos e o desenvolvimento corporal de ratas adultas

O aumento da longevidade evidenciou nas mulheres os efeitos deletérios da deficiência ovariana como, a obesidade central e as doenças neurodegenerativas. Os hábitos alimentares modernos favorecem o consumo excessivo de gorduras, que contribuem para efeitos adversos sobre a saúde, incluindo alteração da composição corporal e da função nervosa. Assim, objetivamos estudar como a dieta hiperlipídica (DH), contendo óleo de soja, associada à perda da função gonadal influenciam o comportamento e o desenvolvimento corporal de ratas adultas. Ratas Wistar adultas foram ovariectomizadas (OVX) ou pseudo-operadas (C) e após 7d passaram a receber dieta contendo 4%(normo) ou 19%(hiperlípidica) de óleo de soja: C4 (n=29), OVX4 (n=30), C19 (n=30), OVX19 (n=30). Foram avaliados a massa e o comprimento corporais e a ingestão alimentar, e aspectos comportamentais de ansiedade, através de teste no Labirinto em Cruz Elevado (LCE); de busca pela novidade, por testes no Campo Vazado (CV); e aprendizagem/memória avaliada no labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB). Ao final dos testes, os animais foram anestesiados, exsanguinados e o tecido adiposo intra-abdominal foi coletado e pesado. O soro foi utilizado para dosagens de triglicerídeo (TG), VLDL-c, colesterol (COL), HDL-c e estradiol. A ingestão alimentar média e o comprimento corporal não diferiram entre os grupos, mas o grupo OVX19 mostrou ganho significativo (13,6%) de massa corporal mais precocemente que os demais. O mesmo padrão foi observado quanto à massa de tecido adiposo, que foi 86% maior no OVX19. Os TG, VLDL e COL aumentaram cerca de 28% no OVX19, porém sem alteração de HDL-c (33,762,2 mg/dl). A DH e a ovariectomia se mostraram ansiogênicos e quando associados, a DH parece reverter o efeito ansiogênico da castração. Padrão similar de resposta foi observado na resposta ao teste de busca por novidade. No teste de aprendizagem/memória o OVX4 apresentou maior tempo de latência no primeiro dia, e todos responderam de forma semelhante nos demais dias. Conclui-se que a deficiência de estradiol acompanhada da ingestão de dieta hiperlipídica mantém o desempenho cognitivo, o comportamento emocional e a motivação, embora prejudique a adiposidade e o metabolismo lipídico.

Autofagia

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Estratégias terapêuticas baseadas na modulação da atividade enzimática das caspases

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Cellular responses to genome mistranslation

Low level protein synthesis errors can have profound effects on normal cell physiology and disease development, namely neurodegeneration, cancer and aging. The biology of errors introduced into proteins during mRNA translation, herein referred as mistranslation, is not yet fully understood. In order to shed new light into this biological phenomenon, we have engineered constitutive codon misreading in S. cerevisiae, using a mutant tRNA that misreads leucine CUG codons as serine, representing a 240 fold increase in mRNA translational error relative to typical physiological error (0.0001%). Our studies show that mistranslation induces autophagic activity, increases accumulation of insoluble proteins, production of reactive oxygen species, and morphological disruption of the mitochondrial network. Mistranslation also up-regulates the expression of the longevity gene PNC1, which is a regulator of Sir2p deacetylase activity. We show here that both PNC1 and SIR2 are involved in the regulation of autophagy induced by mistranslation, but not by starvation-induced autophagy. Mistranslation leads to P-body but not stress-granule assembly, down-regulates the expression of ribosomal protein genes and increases slightly the selective degradation of ribosomes (ribophagy). The study also indicates that yeast cells are much more resistant to mistranslation than expected and highlights the importance of autophagy in the cellular response to mistranslation. Morpho-functional alterations of the mitochondrial network are the most visible phenotype of mistranslation. Since most of the basic cellular processes are conserved between yeast and humans, this study reinforces the importance of yeast as a model system to study mistranslation and suggests that oxidative stress and accumulation of misfolded proteins arising from aberrant protein synthesis are important causes of the cellular degeneration observed in human diseases associated to mRNA mistranslation.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioquímica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

The effect of sucrose on protein stability and fibrillation of prion and S6 protein

Aggregation and fibrillation of proteins have a great importance in medicine and industry. Misfolding and aggregation are the basis of many neurodegenerative diseases like Alzheimer and Parkinson. Osmolytes are molecules that can accumulate within cells and act as protective agents and they can inclusively act as protein stabilizers when cells are exposed to stress conditions. Osmolytes can also act as protein stabilizers in vitro. In this work, two different proteins were studied, the ribosomal protein from Thermus thermophilus and the mouse prion protein. The existence of an unstructured N-terminal on the prion protein does not affect its stability. The effect of the osmolyte sucrose on the fibrillation and stabilization of these two proteins was studied through kinectic and equilibrium measurements. It was shown that sucrose is able to compact the native structure of S6 protein in fibrillization conditions. Sucrose affects also folding and unfolding kinetic of S6 protein, delaying unfolding and increasing folding rate constants. The mechanism of stabilization by sucrose is non-specific because it is distributed for all protein structure, as it was demonstrated by a protein engineering approach. Sucrose delays the process of formation and elongation of S6 and prion protein from mouse. This delay is the result of the compaction of the native structure refered above. However, cellular toxicity studies have shown that fibrils formed in the presence of sucrose are more toxic to neuronal cells.

In vitro blood-brain barrier models to predict the permeation of gene therapy vectors into the brain

A terapia génica tem-se revelado uma alternativa relevante no tratamento de doenças neurodegenerativas (DN). Contudo, a entrega de vetores para transferência génica no cérebro representa ainda um enorme desafio devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE). A BHE é uma interface dinâmica e seletiva entre o sangue e o cérebro, constituída pelas células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos, desempenhando um importante papel na regulação da homeostasia cerebral. A BHE representa um dos maiores obstáculos no tratamento de DN, uma vez que esta barreira impede o transporte para o cérebro da maioria das moléculas terapêuticas, incluindo os vetores para terapia génica. Embora tenham sido desenvolvidos diferentes modelos in vitro da BHE de forma a avaliar o transporte de fármacos através da BHE, muito poucos foram criados com o intuito de testar a permeabilidade desta barreira a vetores de terapia génica. O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e a avaliação de modelos in vitro de BHE que permitam a investigação da capacidade dos vetores de terapia génica de penetrarem no cérebro. No nosso estudo, foram testados diferentes modelos in vitro de BHE em monocultura, constituídos por células endoteliais de rato ou murganho (RBE4 e bEnd3, respetivamente), e modelos de co-cultura, que combinam células endoteliais com células neuronais (Neuro2a) ou astrócitos primários, cultivados num sistema transwell. Para caraterizar estes modelos foram realizados testes de permeabilidade e de resistência elétrica transendotelial, bem como estudos baseados na técnica de PCR quantitativo e na imunocitoquímica das proteínas das junções intercelulares. Verificámos que os modelos baseados na cultura de células bEnd3 e células neuronais ou astrócitos apresentavam as melhores propriedades de barreira. Posteriormente foi avaliada nos modelos selecionados a penetração de um vetor não-viral que reconhecidamente tem a capacidade de atravessar in vivo a BHE: o peptídeo da glicoproteína do vírus da raiva (RGV-9r). Os siRNAs marcados com um fluoróforo e acoplados ao peptídeo RVG-9r foram capazes de penetrar eficientemente as células bEnd3, localizadas no lado luminal do insert, via endocitose mediada por recetores, e ainda de penetrar os astrócitos ou células neuronais, previamente cultivadas no lado abluminal. Estes resultados correlacionam-se, de forma clara, com os resultados previamente descritos em estudos in vivo. Em conclusão, os modelos in vitro de BHE baseados na co-cultura de células bEnd3 com células Neuro2a ou astrócitos, têm grande potencial na seleção de candidatos a vetores de terapia génica para o cérebro, uma vez que apresentam importantes características da BHE e se baseiam num método fácil e reprodutível. Tal facto representa uma promessa significativa para a identificação de novas estratégias de terapia génica não invasiva para o tratamento de doenças neurológicas.

Deciphering the molecular role of DJ-1 in the etiology of Parkinson’s and Huntingtons’s disease

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

The role of alpha-synuclein phosphorylation in synucleinopathies

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

ASYN and tau interaction : new drug target for neurodegenerative diseases

Tese de doutoramento, Bioquímica (Biotecnologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014